冷冻对猪精液酶活性有影响吗？

自从发现甘油的冷冻保护作用以来，各种动物精液冷冻保存技术发展迅速。小鼠、犬和牛的冷冻精液已广泛应用于生产，且人工授精效果接近于鲜精。各国学者在猪精液冷冻载体、冷冻保护剂和冷冻－解冻方法的筛选上进行了积极探索，但其应用效果仍未取得突破性进展。精子含有一个与受精密切相关的酶系，精子酶活性在哺乳动物冷冻精液的品质评定及受精过程中的调控作用已引起有关学者的极大关注，但冷冻对猪精液酶活性影响的报道较缺乏。为了研究猪精液超低温冷冻－解冻后酶活性的变化，本试验对姜曲海猪精液冷冻前后的抗氧化酶、功能性酶和代谢性酶活性进行研究，为完善猪精液的超低温冷冻保存方法提供理论和试验依据。

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材料与方法

1.1　精液采集

采用假阴道法无菌采集4只健康、性成熟姜曲海公猪精液，充分混匀，加入1.5倍37℃预热的稀释液混匀，置于保温桶中1h内带回实验室，评定精子形态完整率和存活率，分别达到80%和70%以上时可用于试验。

1.2　精液冷冻与解冻

冷冻：将稀释后的精液于17℃过夜、离心（800×ｇ，12 min），在沉淀中加入冷冻1液（海藻糖375mmol/L、葡萄糖1.1 g、柠檬酸钠1.48g、Tris2.42 g、青霉素0.06g、链霉素0.1g、20%卵黄，纯化水定容至100mL），4℃平衡1.5h后加入等体积4℃预冷的冷冻2液（在冷冻1液的基础上添加甘油，终浓度为3%），4℃条件下平衡45min，然后分装于0.25mL细管中，置于液氮蒸气预冷10min，投入液氮保存至少1周。

解冻：从液氮中迅速取出细管后投入37℃水浴中，同时迅速晃动，将解冻后的精液收集于10mL试管内，用9倍体积的PBS液清洗。

1.3　精液酶活性的测定

采用Singer法测定透明质酸酶（HYD）活性。取0.25mL精液加入0.15 mol/L NaCl溶液中，于0～4℃离心（600×g，15min），洗涤2次，向沉淀的精子中加入0.1mL乙酸缓冲液（浓度为0.2 mol/L，pH值为5.0），混匀，计数每毫升精子数。然后取0.01mL进行HYD活性的测定，再换算成每千万精子HYD活性，用相当于HYD量的μｇ单位表示。SOD、GR、CAT、ACE、ACP、ATP酶和CK活性按照相关试剂盒说明书进行测定。试验重复3次。

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结果与分析

2.1　冷冻对姜曲海猪精液抗氧化酶（SOD、GR、CAT）活性的影响

与新鲜精液（SOD、GR、CAT活性分别为108.47 U/mL、326.54 U/L、372.41 U/g）比较，冷冻－解冻精液SOD活性（72.26 U/mL）和CAT活性（283.25 U/g）均显著降低，GR活性（644.52 U/L）显著升高。

2.2　冷冻对姜曲海猪精液功能性酶（HYD、ACE）活性的影响

与新鲜精液比较，冷冻－解冻精液HYD活性和ACE活性均显著降低。

2.3　冷冻对姜曲海猪精液代谢性酶（ACP、ATP酶、CK）活性的影响

与新鲜精液（ACP、ATP酶、CK分别为32.47 U/mL、183.62 U/mL、0.38 U/L）比较，冷冻－解冻精液ACP（21.65 U/mL）、ATP酶（92.35 U/mL）、CK（0.17 U/L）活性均显著降低。

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讨论与结论

3.1　冷冻保存对姜曲海猪精液抗氧化酶活性的影响

在长期进化过程中，生物体形成了一套完整的抗氧化保护体系来清除体内多余的活性氧（ROS）。一定程度上，抗氧化酶活性可作为衡量生物体或细胞是否受损的生理指标之一。SOD和CAT是生物体内主要的酶类抗氧化剂，能维持细胞和机体的正常生理活动。J.Sreejith等研究结果表明，冷冻保存牛精子SOD活性明显下降。K.Marta等报道，随低温保存时间的延长，马精子SOD和CAT活性均明显下降。本研究中，姜曲海猪精子经超低温冷冻保存后SOD和CAT活性均显著降低。说明冷冻导致精子细胞内的抗氧化系统受损，进而产生ROS自由基分子，进一步损伤精子。

GR是还原型的谷胱甘肽，也是细胞抗氧化酶系统的一个关键酶，在减缓、清除ROS和环境氧化胁迫中具有重要作用，可稳定膜蛋白结构，抵抗过氧化物，清除自由基。本研究结果表明，姜曲海猪精液超低温冷冻后GR活性显著升高，与黄晓荣等和徐振军等对日本鳗鲡精子和绵羊精子的研究结果一致。浦蕴惠等研究结果表明，随着脊尾白虾精子冻存时间的延长，GR活性逐渐升高，但之后有所下降。超低温冷冻保存引起姜曲海猪精液GR活性变化的原因有待于进一步深入研究。

3.2　冷冻保存对姜曲海猪精液功能性酶活性的影响

HYD是受精过程中的关键酶之一，可为精子运动、精卵结合和形成受精卵创造条件。郑立宏等研究结果表明，各种原因引发的透明质酸酶活性降低均可导致精子受精能力下降。本研究发现，超低温冷冻保存后，姜曲海猪精液HYD活性显著降低，与林金杏等研究结果一致。

ACE是精子顶体部特有的胰蛋白酶，在顶体反应、精卵结合及穿过透明带中起重要作用。许多研究结果表明，顶体酶活性与精子的质量呈正相关，直接影响受精结果。本研究发现，冷冻保存后姜曲海猪精液ACE活性显著降低。林金杏等研究发现，野牦牛精子经超低温冷冻保存后ACE活性显著下降。推测可能是冷冻致精子ACE结构被破坏，进而导致酶活性下降。

3.3　冷冻保存对姜曲海猪精液代谢性酶活性的影响

CK是与细胞内能量运转、ATP再生有直接关系的重要激酶，在预测生育力方面起主要作用。ATP存在于组织细胞及线粒体内膜上，是生物体能量代谢的关键酶，为生物体进行各种生命活动提供能量。研究结果表明，精子ATP酶的活性水平与其活力和运动能力密切相关，是反映精子受精能力的最好标志。本研究结果显示，冷冻后姜曲海猪精子CK活性和ATP酶活性均显著降低，与浦蕴惠等研究结果一致。

ACP是精子顶体反应期间释放的顶体酶类之一，在顶体不同发育期间均可检测出ACP活性。S.Mack等报道，精子在体外获能时，除ACP水平较获能前降低2倍外，其他顶体酶类活性并无明显改变。本研究结果显示，冷冻后姜曲海猪精液ACP活性显著降低，推测可能是冷冻能够诱导精子提前获能，进而导致精子ACP活性降低。

综上所述，冷冻－解冻影响姜曲海猪精子酶系统，导致精子运动能力和抗氧化能力降低，顶体反应、受精卵结合和穿过透明带过程异常，使受精能力下降。

作者 | 张　斌　武彩红　赵旭庭　李　玲

刘　莉　邱树磊　陈晓兰　姚　静

江苏农牧科技职业学院

无锡市农业委员会农业信息服务中心

来 源

《黑龙江畜牧兽医》2018年24期第60-63页，文章原题目：《冷冻保存对姜曲海猪精液酶活性的影响》

版权归原作者所有，向原创致敬